1、紫色桿菌（Chromobacterium violaceum) CV026，自身不產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs）類(lèi)信號(hào)分子，僅當(dāng)外源AHLs信號(hào)分子出現(xiàn)時(shí)，菌株才能夠產(chǎn)生紫色菌素，并檢測(cè)出環(huán)境中的信號(hào)分子C4-HSL～C8-HSL。
2、C.violaceum是一種革蘭氏陰性菌, 其紫色桿菌素的產(chǎn)生受群體感應(yīng)系統(tǒng)的嚴(yán)密調(diào)控, 可以作為群體感應(yīng)抑制活性的篩選模型[1].C.violaceum ATCC12472是一種野生型紫色桿菌, 它可以自主產(chǎn)生信號(hào)分子調(diào)控紫色桿菌素的產(chǎn)生.而C.violaceum CV026是C.violaceum ATCC31532的mini-Tn5的突變體, 不能自主產(chǎn)生信號(hào)分子, 因此不會(huì)產(chǎn)生紫色桿菌素，只有當(dāng)添加外源信號(hào)分子時(shí), 才能啟動(dòng)其群體感應(yīng)系統(tǒng)并產(chǎn)生紫色桿菌素[2].
3、CV026菌種的復(fù)蘇： 將-80℃保存的紫色桿菌CV026接種于LB肉湯，30℃過(guò)夜培養(yǎng)。以2%接入量接種于10 m L含有10μg/mL卡那霉素的LB肉湯中，30℃培養(yǎng)24h,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
4、AHLs標(biāo)準(zhǔn)品：C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-CiO-HSL、3-oxo-Ci2-HSL、3-oxo-Ci4-HSL 購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma。
5、群體感應(yīng) (quorum sensing, QS) 是細(xì)菌細(xì)胞間交流的一種通訊機(jī)制, 具有QS機(jī)制的細(xì)菌通過(guò)感知環(huán)境中低分子質(zhì)量、可擴(kuò)散的信號(hào)分子來(lái)調(diào)控菌體密度,并在信號(hào)分子達(dá)到閾值時(shí)啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá), 從而調(diào)控細(xì)菌的生理行為, 以適應(yīng)環(huán)境的變化。
群體感應(yīng) (Quorum sensing, QS) 是微生物的一種細(xì)胞密度依賴(lài)的信號(hào)傳感系統(tǒng).它可以通過(guò)其自身分泌的信號(hào)分子感知細(xì)胞密度的變化, 一旦細(xì)胞密度達(dá)到閾值時(shí), 會(huì)啟動(dòng)其調(diào)控的基因表達(dá)調(diào)控微生物群體的行為, 如生物發(fā)光、生物膜形成、群集運(yùn)動(dòng)、色素產(chǎn)生以及毒素產(chǎn)生等. 破壞病原菌群體感應(yīng)系統(tǒng)可以顯著降低其毒力因子的表達(dá)水平, 而不影響其生長(zhǎng)繁殖, 理論上不會(huì)導(dǎo)致耐藥性的形成.
6、 細(xì)菌AHLs產(chǎn)物的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案
取待檢測(cè)菌在37度條件下，培養(yǎng)基6ｈ、12ｈ、18ｈ、24ｈ、30ｈ、36ｈ、42ｈ培養(yǎng)菌液，離心（10000轉(zhuǎn)/min，10min)，取上清，保存?zhèn)溆谩?
LB中添加瓊脂（瓊脂添加量1％）滅菌后，將活化的報(bào)告菌紫桿菌CV026取5ml加入到50ml LB瓊脂中，混合均勻后倒平板。待凝固后，在平板中間打孔，將待檢細(xì)菌培養(yǎng)上清液加入孔中。在28度培養(yǎng)24ｈ，觀察顏色變化，測(cè)量變色直徑。CV026菌液自身的上清為陰性對(duì)照。
7、QS抑制劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn):菌株CV026過(guò)夜活化兩次后, 按2%接入量接種于含有20μg/m L卡那霉素的新鮮LB肉湯中, 160 r/min振蕩培養(yǎng)16~18 h, 與100 m L含有20μg/ml C6-HSL (信號(hào)分子) LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合, 倒平板, 待凝固后用牛津杯打孔, 將200μL不同劑量的綠薄荷精油 (0.5、1.0、1.5μL/m L和2.0μL/m L) 加到孔中。將平板置于28℃條件下培養(yǎng)1~2 d, 觀察紫色菌素的產(chǎn)生情況。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液作為陰性對(duì)照。
QS抑制劑 (QS inhibitors, QSIs) 是指那些可以阻斷細(xì)菌種內(nèi)或種間信息交流, 對(duì)細(xì)菌QS現(xiàn)象具有抑制或干擾作用的物質(zhì)。
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[1]DANIEL M, GILLES G, URS S, et al.Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum[J].BMC microbiology, 2004, 4 (1) :1-10.
[2]MOROHOSHI T, KATO M, FUKAMACHI K, et al.Nacylhomoserine lactone regulates violacein production in Chromobacterium violaceum type strain ATCC 12472[J].Fems microbiology letters, 2008, 279 (1) :124-130.
[3]劉麗. 群體感應(yīng)AHLs信號(hào)分子對(duì)魚(yú)源殺鮭氣單胞菌致腐及抗脅迫能力的影響[D].浙江工商大學(xué),2018.
[4]梅永超,李婷婷,劉楠,王當(dāng)豐,赫彬彬,勵(lì)建榮.綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌群體感應(yīng)現(xiàn)象及其腐敗特性的抑制作用[J].食品科學(xué),2018,39(15):17-23.
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